角膜内皮是维持角膜透明性和正常功能的关键。通过离子泵（如Na⁺/K⁺-ATPase）和紧密连接蛋白（如ZO-1），角膜内皮维持基质层的适度脱水。然而，角膜内皮细胞在人体内几乎无再生能力，其密度随年龄增长逐渐下降。内皮细胞功能障碍会导致基质水肿、视力丧失，最终严重影响生活质量。
目前，内皮细胞功能性疾病（如伪晶体性水疱性角膜病和Fuch氏内皮营养不良）已成为角膜移植的主要适应症。这些疾病引发的严重水肿常需通过全厚角膜移植或后部角膜移植（如自动化角膜内皮移植术，DSAEK）治疗。然而，无论采用何种手术方式，内皮细胞在术中和术后的严重丢失仍是一大限制。此外，供体角膜资源的短缺使移植需求远远超出供给。
本研究旨在探索一种组织工程解决方案：通过使用去活化的人类角膜作为载体，培养功能性猫角膜内皮，重建高度细胞化的组织工程角膜内皮（Tissue-Engineered Corneal Endothelium, TE）。这一技术不仅为人类角膜移植提供了潜在的替代方案，也为应对全球供体短缺开辟了新路径。
研究方法
载体制备
- 人类角膜去活化：
- 使用三次冷冻-解冻循环处理人类供体角膜，完全去除内皮、上皮和基质细胞。
- 冷冻后载体被存储于-20°C条件下，最长可保存96天。使用前进行彻底清洗，去除死细胞残留。
- 选择去活化载体的优点：
- 降低免疫原性：去活化可去除所有潜在免疫细胞，减少移植后排斥反应的风险。
- 提高资源利用：利用因内皮或上皮细胞质量不佳而被丢弃的供体角膜，扩充了角膜移植的潜在资源池。
- 灵活保存：冷冻保存的载体可灵活用于计划性移植。
细胞分离与培养
- 猫角膜内皮细胞的分离：
- 从实验用猫眼球的Descemet膜中剥离角膜内皮细胞，并在含高血清的培养基中培养。
- 细胞在FNC涂层培养皿中进行初代培养，传代后以冷冻方式保存。实验中选用低代次细胞并以高密度（3000细胞/mm²）种植在去活化载体上。
- 组织工程角膜内皮的培养：
- 细胞在去活化的Descemet膜上培养2周，期间监测其形态和贴附状态，以观察单层内皮的形成及功能蛋白的表达。
功能与结构评估
- 形态学观察：
- 使用Masson三色染色和扫描电镜观察细胞形态及载体覆盖率。
- 采用Alizarin红染色计算细胞密度，确保其符合移植需求（>1500细胞/mm²）。
- 功能蛋白检测：
- 通过免疫荧光染色检测Na⁺/K⁺-ATPase和Na⁺/HCO₃⁻共转运蛋白等功能相关蛋白，以及紧密连接蛋白ZO-1的表达情况。
- 使用透射电镜观察内皮细胞的超微结构和细胞间连接。
研究结果
- 去活化载体的特性：
去活化后，供体角膜的基质层完全脱细胞，无任何角质细胞或内皮细胞残留。Descemet膜结构完好，适合作为组织工程角膜内皮的培养基质。 - 内皮细胞的生长与形态：
在高密度种植条件下，猫角膜内皮细胞在载体上形成了紧密排列的单层细胞，呈典型的多边形形态。扫描电镜显示，细胞完全覆盖Descemet膜表面，彼此紧密贴附。经过2周培养后，组织工程内皮的平均细胞密度达到2272±344细胞/mm²，超过最低移植标准（>1500细胞/mm²）。 - 功能相关蛋白的表达：
- Na⁺/K⁺-ATPase和Na⁺/HCO₃⁻共转运蛋白：在细胞膜上均有明显表达，提示内皮细胞具备泵水功能。
- ZO-1紧密连接蛋白：免疫荧光显示其定位于细胞间隙，形成完整的紧密连接网络，为维持屏障功能提供了保障。
- 超微结构观察：
透射电镜显示，细胞单层紧密贴附于Descemet膜上，间隙极小，细胞内含丰富的线粒体和内质网，表明细胞代谢活跃，功能状态良好。
讨论与意义
本研究成功展示了利用去活化人类角膜载体重建猫组织工程角膜内皮的可行性。该组织工程角膜内皮具有高细胞密度、良好的形态和功能蛋白表达，为未来角膜移植提供了新思路。
技术优势
- 去活化载体的多重优点：
去活化载体不但降低了免疫排斥风险，还充分利用了传统上被废弃的供体角膜资源，且冷冻保存的灵活性提高了组织工程产品的可用性。 - 高效的组织工程方法：
本研究的高密度种植策略和优化培养条件，使重建的内皮具有接近天然角膜内皮的密度和功能特性，远超当前可接受的移植标准。
未来应用前景
- 临床潜力：
通过使用人类供体角膜载体进行组织工程，未来可在人体实现该技术的转化应用，缓解供体短缺的问题。 - 模型价值：
猫的角膜模型因其内皮细胞的非再生特性，适合作为临床前研究对象，为未来角膜移植疗法的安全性和长期效果提供有力数据支撑。
结论
本研究成功证明了使用去活化人类角膜载体重建高细胞密度、功能良好的组织工程猫角膜内皮的可行性。未来工作将聚焦于移植后的长期透明度与功能评估，为角膜内皮疾病患者提供新的治疗希望。
参考文献：
Tissue Engineering of Feline Corneal Endothelium Using a Devitalized Human Cornea as Carrier