猫肝脏类器官模型是一种创新的体外工具，能够模拟肝脏的功能和病理过程，为研究猫肝脏疾病和筛选治疗药物提供了重要平台。以下从技术和实验操作角度，详细介绍如何建立猫肝脏类器官模型。
1. 样本获取与组织处理
- 样本来源：
肝脏组织可来源于术后剩余组织或已死亡动物的尸检样本。需确保样本新鲜且来源合法，并获得动物主人许可。 - 组织处理：
- 收集的肝脏组织立即放置在冷藏的无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中，避免细胞降解。
- 使用解剖剪和镊子将肝脏组织切割成约1 mm³的小块，去除大血管和非实质部分。
- 样本用含抗生素和抗真菌剂的PBS清洗3次，进一步去除杂质和污染物。
2. 胆管碎片的分离
- 胆管提取：
- 将肝组织块转移至含2 mg/mL IV型胶原酶的酶解液中，37℃孵育30分钟至1小时。
- 轻轻搅拌，释放胆管碎片。通过离心（1000 rpm，5分钟）收集沉淀，弃去上清。
- 胆管纯化：
- 沉淀重新悬浮于冷PBS中，加入30 µm筛网过滤，去除过大的细胞团块。
- 通过反复重悬和离心，获得相对纯净的胆管碎片，用于后续培养。
3. 类器官的培养
- 基质胶准备：
使用Matrigel作为基质支撑材料。将预冷的基质胶按照10 µL/类器官样本的比例稀释，并小心滴加于培养皿或插入物中，形成直径约3–4 mm的小胶滴。 - 初始培养：
- 胆管碎片悬浮于扩增培养基中，滴加至基质胶中央，使其充分嵌入基质胶。
- 将培养皿放入37℃、5% CO₂培养箱中，待基质胶凝固后，加入500 µL扩增培养基，覆盖样本。
- 培养基配方：高级DMEM/F12，添加50 ng/mL EGF、10 µM Y-27632（ROCK抑制剂）、10 nM干细胞因子（SCF）及1%抗生素。
- 扩增培养：
每两天更换培养基。经过5–7天，类器官从胆管碎片生长而成，表现为球状结构，直径在50–200 µm之间。此阶段类器官主要用于扩增目的，可进行多轮传代以提高样本量。
4. 类器官的分化诱导
- 分化培养基更换：
- 将扩增培养基替换为分化培养基，去除ROCK抑制剂和SCF，添加10 µM地塞米松和HGF（肝细胞生长因子），以促进胆管细胞向肝细胞样表型的转化。
- 培养10–14天，每两天更换分化培养基。
- 分化过程：
- 类器官逐渐展现肝细胞表型，形成典型的多层结构。细胞形态更紧密，并表达肝细胞标志物，如白蛋白（ALB）和CYP3A132。
5. 脂肪肝病理模型的建立
- FFA处理：
- 在分化培养的类器官培养基中加入油酸（C18:1，0.4 mM）和棕榈酸（C16:0，0.2 mM），模拟游离脂肪酸在肝脏中的堆积。
- 培养3–5天，期间每日更换含FFA的培养基，逐步诱导类器官内脂质堆积。
- 验证模型成功：
- 使用荧光染料LD540标记脂滴，观察类器官内脂质堆积情况。
- 通过三酰甘油定量试剂盒测量TAG含量，验证模型是否成功模拟脂肪肝的病理特征。
6. 实验注意事项
- 无菌操作：整个实验过程需在超净台内进行，以避免污染。
- 培养基新鲜度：配制培养基时需严格按照实验要求添加新鲜生长因子，并确保培养基保存于4℃，不超过一周。
- 传代时机：类器官直径达到150–200 µm时，可用胰酶消化并重新悬浮于基质胶中进行传代。过早传代会降低活性，过晚传代可能导致坏死。
参考文献：
Identification of potential drugs for treatment of hepaticlipidosis in cats using an in vitro feline liver organoid system