角膜移植是治疗角膜疾病和失明的重要方法，但全球角膜供体短缺已成为限制治疗的主要瓶颈。组织工程技术提供了开发角膜替代物的全新途径，尤其是在生物相容性和功能性重建方面具有巨大潜力。此前的研究已证实，组织工程化的角膜基质（TE-Stroma）在移植后能够长期保持透明性和生物稳定性。然而，作为角膜功能的重要组成部分，神经的再生能力及其对感觉功能恢复的影响尚未被充分研究。本研究旨在通过猫模型评估TE-Stroma移植后的神经再生能力，并验证其对角膜感觉功能的影响。
材料与方法
1. 实验动物与分组
- 动物选择：8只健康成年猫，双眼均正常，无角膜疾病或其他影响因素。
- 分组设计：每只猫的一只眼接受TE-Stroma移植（异种来源或同种来源），对侧眼作为未移植对照。
2. TE-Stroma移植手术
- 材料制备：
- 工程化角膜基质由角膜基质细胞（角质细胞）培养获得，分别使用同种来源（猫）和异种来源（人）的细胞生产。
- 手术操作：
- 在受试眼的角膜基质内注射TE-Stroma材料，确保其均匀分布于移植部位。
- 术后通过标准滴眼液方案预防感染与炎症反应。
3. 随访与功能评估
- 感觉功能评估：
- 使用Cochet-Bonnet角膜测敏仪定期测量角膜周边区域的敏感度（单位为厘米），评估感觉神经功能的恢复过程。
- 神经再生检测：
- 采用共聚焦显微镜（HRT® II Rostock模块）对移植区域和对照区域进行神经密度成像，分别记录以下区域的神经变化：
- Z1：基底神经丛。
- Z2：上皮下神经丛。
- Z3：移植区域内的神经分布。
- 通过ImageJ软件结合NeuronJ插件进行神经计数和密度分析。
- 采用共聚焦显微镜（HRT® II Rostock模块）对移植区域和对照区域进行神经密度成像，分别记录以下区域的神经变化：
- 组织学与免疫荧光检测：
- 终末分析包括透射电子显微镜（TEM）观察新生神经的形态，并通过免疫荧光染色检测神经标志物（神经丝蛋白和IV型胶原）。
结果
1. 感觉功能恢复
- 术前角膜的平均周边敏感度为2.61 ± 0.81 cm。
- 移植术后第3天，敏感度迅速下降至0.1 ± 0.17 cm，显示神经功能的暂时丧失。
- 至术后第58天，感觉功能恢复至接近基线水平（2.2 ± 0.7 cm），4个月后达到3.1 ± 0.6 cm，显示出全面恢复的趋势。
2. 神经密度与分布
- 在移植区域（Z3），新生神经的平均计数和密度分别为39条/mm²和2780 µm/mm²，与对照眼（39条/mm²和2540 µm/mm²）接近。
- 新生神经的密度较高，但排列无序，显示一定程度的组织学异常。
- 异种和同种移植的TE-Stroma在神经再生效果上无显著差异。
3. 组织学与免疫荧光分析
- 免疫荧光检测显示，新生神经表达功能性神经标志物（如神经丝蛋白），并嵌入TE-Stroma基质内部。
- TEM图像显示，新生神经的结构完整，但髓鞘厚度略低于对照组。
讨论
1. TE-Stroma的神经再生能力
本研究证实，TE-Stroma在移植后能够有效诱导宿主的感觉神经再生。移植区域的神经密度达到与对照眼接近的水平，提示TE-Stroma不仅作为物理填充材料，还为神经再生提供了适宜的微环境。2个月的神经再生时间窗口表明，TE-Stroma能够快速整合于宿主组织中。
2. 异种与同种移植的比较
异种和同种来源的TE-Stroma在神经再生方面表现出相似的效果，这为未来使用异种来源材料（如人类来源的TE-Stroma）提供了可能性。然而，新生神经的排列无序可能与移植材料的三维结构有关，提示需要进一步优化其组织学特性。
3. 临床应用潜力
角膜移植的主要限制因素在于供体不足，而TE-Stroma作为替代性材料显示出良好的生物相容性和功能重建能力。本研究为未来的临床应用提供了重要依据，特别是在神经再生和感觉恢复的关键领域。
结论
- 组织工程化角膜基质（TE-Stroma）在猫模型中的移植实验显示出良好的神经再生能力和感觉功能恢复效果。
- 在移植后2个月内，移植区域内形成的神经网络密度接近对照眼，且移植材料未引起显著的生物排斥反应。
- 异种和同种来源材料在效果上无显著差异，为异种移植的潜在临床应用提供了支持。
参考文献：
Reinnervation of corneal stroma reconstructed by tissue engineering transplanted in the living feline model