猫和狗的皮肤真菌病（皮癣菌病），尤其是由 Microsporum canis 引起的感染，是常见的动物皮肤病。治疗通常依赖局部与全身抗真菌药物的联合使用，包括灰黄霉素、伊曲康唑等。然而，这些治疗方案存在显著的局限性，例如药物种类有限、潜在毒性（特别是灰黄霉素）、价格昂贵（如伊曲康唑）、用药不便以及抗药性问题日益突出。因此，开发新型抗皮癣菌药物成为临床和科研的迫切需求。
目前，体外筛选抗真菌药物的方法主要包括微量稀释法和纸片扩散法，但这些方法的实验结果与体内实际疗效往往不一致。原因在于传统方法无法真实模拟真菌与角化组织的相互作用。为克服这一不足，已有研究利用重建的人类表皮模型用于抗真菌药物的体外筛选，并取得了良好的效果。本研究提出了一种新型模型：重建的猫毛囊间表皮（Reconstructed Feline Epidermis, RFE），用于研究 M. canis 与表皮的相互作用，并评估其作为抗真菌药物筛选工具的可行性。
研究方法
1. RFE的构建与培养
- 细胞来源：从已死亡的猫胎儿（经宠物主人许可）分离角质形成细胞和成纤维细胞。
- 构建过程：
- 成纤维细胞与胶原混合，制成真皮等效层，并置于特殊培养插入物上培养24小时。
- 在真皮层表面播种角质形成细胞，并提升培养插入物至气-液界面，模拟表皮的自然生长环境。
- 为促进角化过程，培养插入物在RFE专用培养基中培养14天，期间每两天更换培养基。最终形成了多层角质形成细胞，具有分化的角质层，类似于天然猫表皮。
2. 实验设计与药物测试
- 真菌接种：从标准化培养中提取 M. canis 孢子（IHEM 21239株），调整浓度为1×10⁷个孢子/mL，用于感染RFE。
- 药物筛选：
- 选择咪康唑作为抗真菌测试药物，其最低抑菌浓度（MIC）已知为0.3 µg/mL（通过以往实验确认）。
- 在RFE培养基中添加不同浓度的咪康唑（0.1–1 µg/mL）或溶剂（DMSO），模拟药物治疗环境。
- 每组实验设置三个重复样本，同时设立阳性对照组（不添加药物）。
- 在接种 M. canis 孢子后，将RFE继续培养5天，每天更换培养基。实验结束后，用固定和切片技术评估真菌生长情况。
3. 数据分析与评价
- 病理学检测：通过周期酸-希夫（PAS）染色对RFE样本进行显微观察，记录表皮结构是否被真菌侵染以及真菌生长情况。
- MIC评估：比较不同药物浓度下RFE的感染程度，验证RFE模型在筛选抗真菌药物中的有效性。
研究结果
- RFE的结构与功能
成功构建的RFE表现出与天然猫表皮相似的多层结构，角质层完整且分化良好。在培养过程中，RFE表现出良好的机械稳定性，可承受药物或真菌接种的操作压力，为后续实验提供了可靠的模型基础。 - 咪康唑的抗真菌活性
- 在咪康唑浓度≥0.3 µg/mL时，未观察到 M. canis 侵染RFE或其表面生长，仅偶见非发芽孢子存在。这表明，咪康唑在此浓度下完全抑制了真菌的生长。
- 当咪康唑浓度低于MIC（0.1或0.2 µg/mL）时，仅观察到少量孢子萌发，部分形成短菌丝，提示低浓度咪康唑具有部分抑菌活性。
- 在未添加咪康唑的对照组中，真菌菌丝明显侵入角质层，表现出典型的感染模式。
- 模型的药物筛选潜力
实验结果显示，RFE对咪康唑的渗透性良好，能够真实反映药物在角化组织中的作用效果。模型在检测药物对感染阶段（如孢子和菌丝）的抑制效果方面表现出显著优势。
结论
本研究首次建立了一种重建猫毛囊间表皮的体外模型（RFE），并验证其在筛选抗 M. canis 药物中的有效性。RFE成功模拟了真菌感染与表皮的相互作用，为抗真菌药物的筛选和机制研究提供了一种精准而高效的工具。
参考文献：
Reconstructed interfollicular feline epidermis as a model for the screening of antifungal drugs against Microsporum canis