多发性硬化症（Multiple Sclerosis, MS）是一种以中枢神经系统脱髓鞘和轴突损伤为主要特征的神经退行性疾病。为了研究其病理机制及寻找有效的治疗手段，建立合适的动物模型至关重要。在波斯猫中通过乙啶溴（Ethidium Bromide, EB）诱导脊髓脱髓鞘损伤是一种成熟且有效的多发性硬化症实验模型。以下从技术和实验操作角度详细介绍其建立方法。
一、实验前准备
- 实验动物选择
- 动物种类：选择波斯猫或其他合适的猫种。
- 动物年龄与体重：通常选用健康、体重在2~3kg的成年猫。
- 健康筛查：在模型建立前，对实验猫进行全身体检，包括血液检查、尿液检查和心肺功能测试，确保无潜在疾病。
- 实验环境
- 实验室环境：保持清洁和无菌，环境温度控制在20~25℃，湿度保持在50%~60%。
- 饲养条件：单独笼养，每日喂食高质量猫粮，并提供充足的水。
- 实验药物和设备
- 诱导药物：乙啶溴（EB）。
- 注射设备：注射用生理盐水，精准注射器（如1mL针筒，配备30G针头）。
- 麻醉药物：氯胺酮、异氟烷。
- 定位设备：脊髓注射辅助器械（如脊柱定位仪）。
二、模型建立步骤
- 麻醉与固定
- 麻醉：采用氯胺酮（10~15mg/kg）与异氟烷联合麻醉，确保猫进入深度麻醉状态，避免实验过程中出现挣扎。
- 固定：将猫仰卧放置在实验操作台上，使用四肢固定带限制其移动，暴露背部以便进行脊髓操作。
- 手术部位处理
- 剃毛：在背部脊椎区域剃除毛发，清洁手术区域。
- 消毒：用0.5%的碘伏和75%的酒精交替消毒手术区域。
- 脊髓注射
- 定位脊髓区域：通过触诊和解剖标志（如棘突）确定注射部位，一般选择胸椎或腰椎段。
- 穿刺：使用30G细针，沿脊椎间隙小心插入至脊髓内，确保针头位置准确。
- 药物注射：
- 配制0.03%~0.1%的乙啶溴溶液。
- 缓慢注射至脊髓，注射体积根据猫体重调整为5~10μL，注射速度控制在1μL/10秒。
- 注意事项：注射过程中需避免出现明显的阻力或猫的异常反应。如果发生漏液或血液回流，应重新调整注射位置。
- 注射后观察
- 拔针与封闭：注射完成后，缓慢拔针，用无菌敷料覆盖注射部位，并用绷带固定。
- 清醒与监测：将猫转移至恢复区，待麻醉苏醒后密切观察其生命体征和行为变化。
三、脱髓鞘模型的验证
- 行为学观察
- 记录猫的运动功能、协调性以及后肢力量是否减弱，评估脱髓鞘损伤的表现。
- 常见症状包括运动障碍、跛行甚至轻微瘫痪。
- 影像学检查
- MRI检查：在注射后7~14天进行磁共振成像（MRI），观察脊髓白质区域的脱髓鞘损伤和病灶范围。
- 组织学检测
- 样本采集：取脊髓病变部位的组织，进行HE染色和髓鞘染色（如LFB染色）。
- 脱髓鞘验证：在显微镜下观察髓鞘结构的丢失和神经纤维的损伤。
- 炎症因子检测
- 通过酶联免疫吸附实验（ELISA）检测脊髓组织中炎症因子的水平（如IL-1β、TNF-α）。
四、注意事项
- 药物剂量控制
- 乙啶溴的浓度和注射体积需严格控制，以避免过度损伤导致模型失败或动物死亡。
- 操作精度
- 脊髓注射是一项高精度操作，需确保针头准确进入目标区域，否则可能导致非特异性损伤或药物扩散至其他组织。
- 动物福利
- 模型建立后，需为猫提供良好的术后护理，包括镇痛管理（如布洛芬）和饮食调控，确保动物的基本生理需求得到满足。
- 伦理审批
- 所有实验操作需符合动物实验伦理规定，确保模型建立的科学性和人道性。
五、总结
多发性硬化症猫模型的建立依赖于精确的脊髓注射技术以及严格的术后护理管理。通过乙啶溴诱导脊髓脱髓鞘损伤，不仅能成功模拟MS的病理变化，还能为研究MS的机制和治疗提供宝贵的实验平台。然而，实验中需严格遵守剂量和操作规范，以确保模型的稳定性和可重复性。未来，通过该模型的应用，有望进一步推动多发性硬化症治疗方法的研究。
参考文献：
Laser-activated autologous adipose tissue-derived stromal vascular fraction restores spinal cord architecture and function in multiple sclerosis cat model