心肌缺血-再灌注（ischemia-reperfusion, I/R）损伤是急性心肌梗死治疗中的重要研究课题。再灌注虽恢复了血流灌注，但可能引发严重的心肌组织损伤。动物模型在研究I/R损伤的机制及干预手段中发挥了重要作用，其中猫因其心脏解剖和生理特点与人类接近，是一种理想的研究模型。本文将从实验设计、技术操作和关键注意事项等方面，详细介绍如何建立猫心肌I/R损伤模型。
实验设计
1. 动物选择与伦理审查
- 实验对象：成年雄性健康猫，体重2.5-4公斤，性别不限。选择健康个体以确保实验一致性。
- 伦理审批：所有实验需符合动物实验伦理准则，并获得伦理委员会的批准。应最大程度减少实验对动物的痛苦。
操作步骤
1. 手术前准备
- 麻醉与术前监测：
- 使用异氟醚气体诱导麻醉，通过气管插管维持全麻状态。
- 持续监测心率、血压、呼吸频率和血氧饱和度，确保动物生命体征稳定。
- 开胸手术：
- 将猫固定于手术台上，以仰卧位暴露胸腔。
- 在第四或第五肋间做左胸侧开口切口，暴露心脏。
2. 缺血模型的建立
- 冠状动脉阻断：
- 使用心包牵开器将心脏轻轻向外牵引，暴露左前降支冠状动脉（LAD）。
- 用5-0聚丙烯线（Prolene）在LAD下穿过心外膜并环绕该动脉，同时在线的两端夹上硅胶小管形成可调控的“套索”。
- 拉紧套索并打结，阻断血流，标记开始缺血的时间。缺血时间通常为1.5小时。
- 缺血评估：
- 缺血开始后，观察心肌颜色变化（心肌区域变为苍白），可作为血流中断的直观验证。
- 缺血期间，每隔15分钟监测心率、血压和呼吸状况，记录任何异常反应。
3. 再灌注的实现
- 解除结扎：
- 在缺血1.5小时后，小心松开套索并恢复冠状动脉血流，标记再灌注开始时间。
- 观察心肌颜色的恢复（从苍白转为红润），这是再灌注成功的标志。
- 再灌注持续时间：
- 再灌注通常维持4.5小时，用于观察心肌损伤的进展和评估实验干预效果。
4. 样本采集与终点检测
- 心肌组织采样：
- 实验结束后，在全麻状态下实施安乐死，迅速取出心脏。
- 使用Evans蓝染色标记心肌未灌注区域，随后用四唑蓝（NBT）染色标记存活组织，计算心肌坏死区与风险区的比例。
- 髓过氧化物酶（MPO）活性检测：
- 提取心肌组织检测MPO活性，评估中性粒细胞的浸润程度。
- 冠状动脉功能检测：
- 取出冠状动脉环进行离体实验，评估内皮依赖性（乙酰胆碱）和非依赖性（NaNO2）血管舒张功能。
技术注意事项
- 血流阻断的精准性：
- 冠状动脉套索的固定和松紧应适度，以确保有效阻断血流而不损伤心肌组织。
- 缺血过程中需严格监控生命体征，任何异常情况需立即干预。
- 开胸手术的操作细节：
- 确保切口足够小以减少创伤，但足以充分暴露心脏。
- 开胸后应定期吸引胸腔内液体，避免术中影响呼吸。
- 再灌注操作的平稳性：
- 松开套索时应缓慢释放，以避免因血流骤然恢复导致的“再灌注冲击”，进一步损伤心肌。
- 监测再灌注期间心律失常的发生，如出现持续性心律失常可给予电复律或药物治疗。
- 术后组织标记的精确性：
- 使用Evans蓝和NBT染色区分坏死和存活组织时，操作应快速、精准，避免人为误差。
总结
通过冠状动脉套索结扎方法，能够成功建立猫心肌缺血-再灌注损伤模型，该模型具有显著的心肌坏死、中性粒细胞聚集和内皮功能障碍等特征，真实再现了人类急性心肌梗死的关键病理变化。这一模型为研究I/R损伤的分子机制及干预策略提供了可靠的实验基础，同时也为评估潜在治疗药物（如单克隆抗体DREG-200）的疗效奠定了基础。
参考文献：
Monoclonal Antibody to L-Selectin AttenuatesNeutrophil Accumulation and ProtectsIschemic Reperfused Cat Myocardium