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体外猫血脑屏障（BBB）模型的建立方法

体外血脑屏障（Blood-Brain Barrier, BBB）模型是研究神经病理、生物屏障功能以及病毒和药物在中枢神经系统（CNS）中的作用的重要工具。本文将详细介绍一种体外猫 BBB 模型的建立方法，重点阐述实验设计、细胞培养和功能验证的技术细节。

一、模型的设计与组成

体外猫 BBB 模型旨在重现血脑屏障的结构与功能。该模型由以下两种主要细胞组成：

  1. 猫脑血管内皮细胞（Feline Brain Endothelial Cells, FBECs）：
    • 模拟 BBB 的内皮层，提供紧密连接形成物理屏障。
    • 内皮细胞通过特定蛋白（如 occludin 和 ZO-1）形成紧密连接。
  2. 猫星形胶质细胞（Astrocytes）：
    • 模拟神经系统侧，分泌多种因子以支持 BBB 的成熟和功能。

这两种细胞共同培养，形成一个双层系统，分别代表血侧和脑侧。

二、模型的建立步骤

1. 细胞的分离与培养

（1）猫脑血管内皮细胞（FBECs）的分离：

  • 组织来源： 从健康猫脑组织中分离脑血管。
  • 分离步骤：
    1. 将脑组织切割成小块，通过机械分离法提取微血管。
    2. 使用胶原酶和胰蛋白酶消化微血管，释放内皮细胞。
    3. 使用差速离心法富集内皮细胞。
  • 培养条件：
    • 培养基：RPMI-1640 或 DMEM，添加 10% 胎牛血清、2 mM 谷氨酰胺、抗生素（青霉素和链霉素）。
    • 涂覆基质：使用鼠尾胶原或牛纤维连接蛋白涂覆培养基底，以促进细胞附着。

（2）猫星形胶质细胞的分离：

  • 组织来源： 提取自猫脑皮层。
  • 分离步骤：
    1. 使用胰蛋白酶和脱氧核糖核酸酶（DNase）消化组织。
    2. 使用差速离心分离星形胶质细胞。
  • 培养条件：
    • 培养基：高糖 DMEM，添加 10% 胎牛血清。
    • 涂覆基质：与内皮细胞相同，使用鼠尾胶原或纤维连接蛋白。

2. 体外双层培养系统的构建

（1）使用多孔滤膜构建培养系统：

  • 选用聚对苯二甲酸乙二酯（PET）滤膜（孔径 3 µm），其两侧分别培养内皮细胞和星形胶质细胞。
  • 滤膜涂覆：
    1. 在滤膜上涂覆鼠尾胶原和牛纤维连接蛋白。
    2. 使滤膜的两侧都能提供适合细胞附着的基底。

（2）细胞培养：

  1. 血侧（内皮细胞）：
    • 将 FBECs 接种在滤膜的上层（血侧），培养 7 天，直至细胞形成单层并显示紧密连接特征。
  2. 脑侧（星形胶质细胞）：
    • 将星形胶质细胞接种在滤膜的下层（脑侧），同步培养。

（3）共培养：

  • 将滤膜放置在双室培养系统中，共培养内皮细胞和星形胶质细胞，使其通过分泌因子相互作用，形成功能性 BBB。

3. 紧密连接和屏障功能的验证

（1）紧密连接蛋白的检测：

  • 使用 Western blot 或免疫荧光技术检测内皮细胞紧密连接蛋白（如 occludin 和 ZO-1）的表达。
  • 观察蛋白分布是否沿细胞边缘排列，以验证紧密连接的形成。

（2）屏障完整性的评估：

  • 荧光标记渗透实验：
    • 在滤膜顶部（血侧）加入 FITC 标记的葡聚糖（分子量 4 kDa）。
    • 每隔 15 分钟在脑侧采样，使用荧光分光光度计检测荧光强度。
    • 通过计算表观渗透系数（Papp）评估屏障的渗透性。

（3）转运和细胞迁移测试：

  • 在血侧加入待测试分子或细胞（如病毒、淋巴细胞），评估其是否穿过滤膜进入脑侧。
  • 使用计数仪（如 Vi-Cell）或逆转录酶活性检测转运量。

结论

体外猫 BBB 模型的建立为研究病毒与中枢神经系统的相互作用提供了强有力的工具。通过模拟真实的血脑屏障结构，该模型在神经病理学、药物筛选及炎症研究等领域具有重要应用价值。未来的研究可结合更多细胞类型和动态检测技术，进一步提升模型的生理相关性和应用广度。

参考文献：

Lymphocyte migration through the blood–brain barrier (BBB) in feline immunodeficiency virus infection is significantly influenced by the pre-existence of virus and tumour necrosis factor (TNF)-α within the central nervous system (CNS): studies using an in vitro feline BBB model