特发性膀胱炎（Feline Idiopathic Cystitis, FIC）是家猫常见的下尿路疾病，以血尿、排尿困难、疼痛和膀胱高敏感性为主要特征。尽管其病因尚未完全明确，FIC被认为是一种复杂的多因素疾病，涉及膀胱、神经内分泌系统和外部环境的相互作用。应激被认为在其发病中扮演重要角色，尤其是与去甲肾上腺素（norepinephrine, NE）等应激荷尔蒙的升高密切相关。
本研究开发了一种原代猫尿路上皮细胞（uroepithelial cells, UEC）培养模型，用于研究NE诱导的炎症反应、氧化应激和屏障功能障碍在FIC中的作用。通过这一模型，研究者可以在体外探讨应激和膀胱炎症的机制，并为未来FIC的治疗策略提供新见解。
材料与方法
1. 猫尿路上皮细胞的分离与培养
- 细胞来源：从一只经安乐死的健康家猫的膀胱组织中分离尿路上皮细胞（经动物伦理委员会批准）。
- 处理步骤：
- 切除膀胱后，用Krebs溶液清洗，并剥离平滑肌层。
- 将膀胱组织放入含有Dispase的培养基中，4°C孵育过夜，松解上皮细胞。
- 进一步使用胰酶-EDTA消化细胞，并通过离心和过滤分离上皮细胞。
- 细胞悬液经染料排除试验确认细胞活性，细胞活性超过80%时可用于培养。
- 培养条件：细胞接种于涂有IV型胶原的培养板中，37°C、5% CO₂环境下培养6天。培养基每24小时更换一次。
2. NE处理实验设计
- 处理方法：在培养第6天，分别用不同浓度（10 µM、100 µM和1000 µM）的NE处理细胞1小时。
- 观察时间：处理后，允许细胞在无NE环境下恢复24小时，以模拟急性应激后的恢复过程。
3. 关键检测指标
- 炎症反应：
- 测量培养基中的IL-6（白介素6）和SDF-1（基质细胞来源因子1）浓度。
- 氧化应激：
- 测定细胞裂解液中的蛋白碳基化水平（PC）和8-OHdG（氧化DNA损伤标志物）。
- 屏障功能：
- 测量培养基中的糖胺聚糖（GAG）浓度；
- 检测紧密连接蛋白Claudin-4的表达量；
- 通过跨上皮电阻（TER）评估细胞屏障完整性。
结果
1. NE诱导的炎症反应
- IL-6浓度：高浓度NE（1000 µM）显著增加IL-6的分泌，而较低浓度（10 µM、100 µM）无显著变化。
- SDF-1浓度：所有NE处理组的SDF-1水平均显著升高，表明其对NE刺激更敏感。
2. NE引发的氧化应激
- 蛋白损伤：1000 µM NE处理显著增加PC水平，提示高浓度NE诱导蛋白质氧化损伤。
- DNA损伤：100 µM NE处理意外降低了8-OHdG水平，可能反映了细胞的代偿性应激反应。
- 其他标志物：脂质过氧化标志物MDA和内质网应激蛋白GRP78未见显著变化。
3. 屏障功能的损害
- GAG浓度：100 µM NE显著降低培养基中的GAG含量，而其他浓度无显著影响。
- Claudin-4表达：所有NE处理组Claudin-4水平均显著下降，表明紧密连接受损。
- TER值：高浓度NE（100 µM、1000 µM）显著降低TER值，即刻和24小时后均未恢复，显示NE对上皮屏障完整性具有持久影响。
讨论
本研究首次建立了一种以猫尿路上皮细胞为基础的体外模型，用于研究FIC的病理机制。研究表明，急性NE暴露可显著增加炎症因子（IL-6和SDF-1）分泌，诱导氧化应激并破坏上皮屏障功能。
- NE在FIC中的作用：FIC猫的NE水平在静息状态下持续升高，这可能通过激活α1肾上腺素能受体导致膀胱屏障功能障碍和炎症反应。本研究的数据支持这一假设，并进一步揭示NE对紧密连接蛋白和糖胺聚糖层的破坏作用。
- 屏障功能的改变：Claudin-4的减少和TER值的降低表明，NE可以削弱尿路上皮细胞的屏障功能。这种屏障功能的减弱可能是FIC疼痛和膀胱高敏感性的重要机制。
- 氧化应激的复杂性：尽管NE在蛋白质氧化损伤中起作用，但对DNA和脂质氧化的影响似乎相对有限。这提示了猫尿路上皮细胞对短期应激的特定适应机制。
结论
本研究开发的原代猫尿路上皮细胞培养模型，为研究FIC的病理机制提供了一个可靠的平台。通过模拟应激激素NE的作用，我们验证了其在炎症反应、氧化应激及屏障功能障碍中的关键角色。这一模型不仅有助于理解FIC的病理过程，还为探索潜在治疗策略提供了重要工具。
参考文献：
Feline Uroepithelial Cell Culture as a Novel Model of Idiopathic Cystitis: Investigations on the Effects of Norepinephrine on Inflammatory Response, Oxidative Stress, and Barrier Function