角膜内皮细胞是维持角膜透明性和脱水功能的重要组成部分。由于其极低的再生能力，任何角膜内皮的损伤或功能丧失都会导致角膜水肿和混浊。为了研究角膜内皮病变的病理机制及开发治疗方法，动物实验模型成为必要工具。猫角膜的大小和结构与人类相似，是研究角膜疾病的重要模型之一。本文将详细描述如何建立一种可靠的猫角膜内皮缺陷模型，用于评估新型角膜内皮修复疗法。
1. 实验动物选择与准备
1.1 动物选择
- 品种：选用健康成年猫，性别不限，体重范围为3-5千克。
- 健康检查：实验前需进行全面的健康评估，确保猫眼部无疾病（如角膜炎或其他病变）。
1.2 动物管理
- 动物应在无菌、温控环境中饲养（温度20-22°C，湿度40%-60%）。
- 光照条件应为12小时光/12小时暗，确保动物适应实验室环境。
2. 手术前准备
2.1 麻醉
- 使用吸入麻醉（如异氟醚）结合肌肉松弛剂，确保手术期间猫无痛且充分镇静。
- 麻醉前给予局部麻醉滴眼液（如0.5%盐酸丙美卡因）减少眼部敏感性。
2.2 无菌操作
- 手术过程中需严格执行无菌操作，包括使用无菌器械、手术罩单及手术手套。
- 术前使用稀释的碘伏清洗眼周，并用生理盐水冲洗眼表。
3. 角膜内皮缺陷的诱导
3.1 刮除内皮细胞
- 切口设计：
- 通过透明角膜缘制作1-2毫米的小切口，使用显微手术刀切开前房角膜组织，避免损伤周围组织。
- 前房注射：
- 使用微量注射器通过切口注射平衡盐溶液（BSS），维持前房形态，避免塌陷。
- 内皮去除：
- 使用特殊设计的刮除工具（如硅胶刮刀或柔软的棉签）在显微镜下轻轻刮除角膜中心的内皮细胞（直径约6毫米）。
- 去除时避免损伤Descemet膜，以保留基底结构作为后续研究的附着位点。
3.2 确保完整去除
- 刮除后用生理盐水冲洗角膜内表面，确保所有内皮细胞被清除。
- 使用荧光染料（如Trypan Blue）标记去除区域，进一步确认内皮细胞缺失的范围和完整性。
4. 模型验证与监测
4.1 初步验证
- 术后1小时通过裂隙灯显微镜检查角膜透明度和水肿程度。角膜的迅速混浊和中央水肿表明模型建立成功。
- 观察眼部是否存在其他并发症（如前房出血或角膜机械损伤）。
4.2 长期监测
- 角膜中央厚度（CCT）：使用角膜测厚仪记录术后角膜厚度的变化。内皮缺失会导致CCT显著增加。
- 眼内压（IOP）：用眼压计测量术后眼压，确保前房形态稳定。
- 炎症反应：通过裂隙灯观察前房炎症迹象，如细胞沉积或纤维蛋白形成。
5. 后续实验操作（可选）
5.1 细胞注射治疗
- 模型建立后可进一步用于细胞治疗实验：
- 细胞来源：异种（如人类角膜内皮细胞）或同种来源的内皮细胞。
- 注射方法：将细胞悬浮液注入前房，并调整猫体位（眼部向下）以促进细胞在Descemet膜上的附着。
- 辅助手段：在细胞悬浮液中加入ROCK抑制剂以增强细胞粘附和存活。
5.2 功能恢复评估
- 透明度评分：通过观察角膜透明度变化评估修复效果，评分范围从0（完全混浊）到4（完全清澈）。
- 组织学分析：在实验结束后取角膜组织，进行组织切片和免疫荧光检测（如Na+/K+-ATPase和ZO-1染色）以验证内皮功能恢复。
参考文献：
In vivo functionality of a corneal endothelium reconstituted by injection of endothelial cells in the anterior chamber of a feline model